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SV-AUC在慢病毒載體表征中的突破性應用：超越傳統技術的高分辨率分析

貝克曼庫爾特生命科學 2024-11-15 | 閱讀：1785

慢病毒載體（Lentivirus Vectors, LVV）是一類由類逆轉錄病毒（Lentivirus）衍生的病毒載體，廣泛應用于基因治療領域。逆轉錄病毒（Retroviruses）是一類能夠將其基因組整合到宿主細胞DNA中的病毒，這種特性使得它們非常適合作為基因傳遞工具。在這些逆轉錄病毒中，人類免疫缺陷病毒（HIV）及其衍生病毒最為知名，后者被用作為制作LVV的基礎。與常規逆轉錄病毒不同，Lentivirus具有能感染靜止細胞的能力，因此能高效地將外源基因傳遞給細胞，從而在基因治療中發揮重要作用。

LVV主要通過重組技術從HIV等病毒中提取并修改其基因組，以去除病毒的致病部分并引入目標基因，使其能夠安全、有效地傳遞遺傳物質。這些載體已被用于多種臨床試驗中，尤其是對于遺傳性疾病的治療和癌癥免疫療法的研究。與其他病毒載體（如腺病毒或腺相關病毒）相比，LVV具有以下優勢：

1長期表達

LVV能夠將基因整合到宿主細胞的基因組中，提供長期的基因表達。

2高效傳導

由于其能夠感染多種類型的細胞，尤其是非分裂期的細胞，LVV在基因轉導方面具有較高的效率。

3廣泛適用性

LVV適用于多種哺乳動物細胞，包括人類細胞，是許多基因治療策略中最常見的載體之一。

LVV載體結構

然而，LVV的生產過程中仍面臨許多挑戰，尤其是在病毒顆粒的純化和表征方面。生產LVV時，通常需要高效的病毒顆粒分離和純化技術，因為這些病毒載體往往和其它雜質（如病毒宿主細胞雜質、未包裝的病毒蛋白、外源基因產品等）混雜在一起，這些雜質可能影響最終的產品質量，甚至產生不良反應。鑒于LVV對病毒顆粒的質量和純度要求較高，開發可靠的分析技術來表征這些顆粒變得至關重要。

作者評估了幾種顆粒表征技術在分析兩種不同生產工藝下制造的LVV產品中的應用。具體而言，研究關注的是來自懸浮培養工藝（材料1）和貼壁培養工藝（材料2）的LVV樣品。研究的目標是評估動態光散射（DLS）、成像光學顯微鏡（ILM）、納米顆粒追蹤分析（NTA）、微流脈沖納米分析技術（MRPS）和沉降速度分析超速離心（SV-AUC）等五種分析技術在粒徑分布、純度以及顆粒雜質存在的表征中的有效性。

材料1的p24 ELISA滴度是材料2的三倍，表明材料1每毫升包含的病毒顆粒更多。然而，材料1的渾濁度較高，說明其中含有較多的大顆粒雜質。相對而言，材料2的渾濁度較低，雜質較少。兩種樣品在分析前都需要進行稀釋，其中材料1的稀釋倍數較大，因為其渾濁度較高。

材料1和2

分析技術的比較評估

DLS：動態光散射（DLS）作為一種廣泛應用的顆粒大小分析技術，在LVV樣品的表征中面臨困難，尤其是樣品的多分散性和顆粒雜質影響了數據的可靠性。該方法生成了寬泛的、未分辨的粒徑分布峰，無法準確測量LVV顆粒的大小，特別是在顆粒雜質較多時。因此，DLS并不適合分析這些復雜樣品。

ILM和NTA：在成像光學顯微鏡（ILM）和納米顆粒追蹤分析（NTA）中，材料1的粒徑分布表明存在較多的大顆粒雜質，尤其是在未過濾的樣品中。雖然過濾去除了部分大顆粒，但小顆粒雜質仍然影響結果。ILM分析顯示，材料1過濾后，顆粒濃度減少了約50%，粒徑分布有所變化，這表明通過過濾去除了較大的顆粒。然而，由于儀器的低敏感性，ILM在較小顆粒的檢測上存在局限，容易出現誤解。NTA提供了比ILM更可靠的數據，但仍然難以區分LVV顆粒和雜質，尤其是在復雜、寬分布的材料1樣品中，LVV顆粒與雜質難以區分。

MRPS: 微流脈沖納米分析技術（MRPS）在過濾后的樣品中表現良好，能夠更準確地測量材料2的顆粒大小分布。然而，未過濾的材料1在MRPS分析中導致了卡管現象，使得該技術在未過濾的材料1樣品中不適用。雖然MRPS能夠成功表征材料2中的LVV顆粒，但在材料1中，小顆粒雜質與LVV顆粒重疊，需要通過手動數據處理才能分辨出LVV的峰值。

SV-AUC：沉降速度分析超速離心 (SV-AUC) 是一種有前景的LVV表征技術, 在所有測試的技術中， SV-AUC表現出了最好的結果，特別是對于含雜質較少的材料2。SV-AUC能夠通過沉降系數分離不同粒徑的顆粒，這對于分析具有不同粒徑的顆粒混合物非常有優勢。通過對樣品施加離心力，SV-AUC能夠根據顆粒沉降速度提供清晰的顆粒分布圖譜。作者研究發現，SV-AUC通過在7,000 rpm下進行離心，成功檢測到了材料2中的LVV顆粒，并揭示了一個沉降系數約為650 S的峰值，這與文獻中報道的逆轉錄病毒的沉降系數（600 S）相符。這一發現表明，SV-AUC在LVV顆粒的表征中具有很高的特異性。

SV-AUC的兩步離心方法進一步提高了分辨率。在第一步中，使用7,000 rpm的中速離心來分離LVV顆粒和大顆粒雜質。在第二步中，采用更高的離心速度（42,000 rpm）來更好地分離較小的雜質，包括人白蛋白等蛋白質。這種雙重離心方法使得研究能夠在同一實驗中分離出LVV顆粒和更小的雜質顆粒。從SV-AUC獲得的沉降系數分布顯示，材料2中在650 S左右有一個清晰的峰值，并且A260/A280的比值為1.3，這表明該峰值很可能對應于LVV顆粒，符合LVV顆粒通常由核酸和蛋白質組成的特點。這一結果驗證了SV-AUC作為一種可靠的LVV顆粒表征方法的有效性，尤其在純凈的樣品中具有良好的適應性。

AUC分析結果

總結和展望

盡管SV-AUC在材料2中表現出了良好的分辨能力，但在材料1中，由于存在大量大顆粒雜質，導致LVV顆粒被淹沒，因此難以準確分辨出LVV顆粒。SV-AUC作為一種強有力的粒徑分布表征技術，在分析LVV顆粒時具有顯著優勢，尤其適用于雜質較少的樣品。SV-AUC能夠基于沉降系數分離病毒顆粒，結合雙步離心方法，可以準確檢測LVV顆粒并與雜質區分開來。盡管在更復雜的樣品中，SV-AUC的應用仍然面臨挑戰，但它為LVV產品的質量控制提供了一個有前景的解決方案。未來，改進樣品制備技術，如選擇性去除雜質或富集LVV顆粒，可能會進一步提高SV-AUC在日常應用中的適用性。

參考文獻：

Stadler D, Helbig C, Wuchner K, Frank J, Richter K, Hawe A, Menzen T. Challenges in the analysis of pharmaceutical lentiviral vector products by orthogonal and complementary physical (nano)particle characterization techniques. Eur J Pharm Biopharm. 2024 Jul;200:114340. doi: 10.1016/j.ejpb.2024.114340. Epub 2024 May 24. PMID: 38797222.

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